Boas Práticas com o HPLC

Vou descrever alguns cuidados que devemos ter quando estivermos operando um High Performance Liquid Chromatography (HPLC) e alguma dicas que podem ajudar muito na rotina do laboratório analítico. Para facilitar um pouco o entendimento do artigo, separei o tema em 5 itens de maior relevância. Vamos lá!

1° Item: Frascos para acondicionamento dos solventes:

• Todos os frascos de solventes devem ser acondicionados acima do nível das bombas do equipamento, fazendo assim uma força natural de trabalho;

• Todos os frascos acondicionados acima do equipamento devem estar em bandejas de contenção para evitar vazamento dos líquidos e danificar o equipamento;

• Toda solução aquosa deverá ser armazenada em frasco de vidro de borossilicato âmbar para evitar a formação de biofilme;

• Os frascos dos solventes sempre deverão ser rotulados, identificando a data do preparo, o conteúdo do frasco e a validade;

• Frascos de vidro borossilicato tipo 1, classe A ou tipo 3.3 são inertes à maioria dos reagentes utilizados em cromatografia;

• As tampas dos frascos de vidro devem conter filtro de ar e engate rápido. Estas tampas evitam a contaminação com outros solventes e minimizam a evaporação. Atenção: Não utilizar Parafilm para vedar as tampas, pois contaminam os solventes e não são bons vedantes na evaporação.

2° item: Especificação dos solventes para fase móvel:

• Água ultrapura

  1. TOC: < 5ppb (Quanto maior o TOC, menor será a sensibilidade dos detectores óticos);

  2. Resistividade > 18,2 μΩ cm 25°C ou condutividade 0,054 μS/cm a 25°C ( Ω=1/S) (Quanto menor a resistividade, maior é a condutividade, ou seja, maior presença de sais dissolvidos na água. Esta maior presença de sais na água, impacta diretamente no ajuste de tamponamento da fase móvel;

  3. Filtro de saída da água: 0,22 μm;

  4. Para garantir estas especificações da água de saída, o equipamento ultrapurificador deverá receber água com no máximo 50ppb de TOC.

• Solventes orgânicos

  1. Acetonitrila e metanol são usualmente utilizados em cromatografia liquida. A recomendação é que a aquisição destes reagentes seja em grau HPLC ou superior e sempre que possível, os reagentes certificados de pré-filtração (filtração 0,22μm descritos no rótulo ou no certificado), para evitar contaminação com filtragens no momento do uso;

  2. Caso necessite filtrar o solvente, verifique a compatibilidade entre o solvente e a membrana filtrante;

  3. A desgaseificação dos solventes orgânicos puros ou em misturas de fase móvel garantem uma melhora significativa na eficiência dos resultados de cromatografia liquida. Embora os sistemas HPLC possuírem desgaseificador, muitas vezes não é suficiente devido ao excesso de gases dissolvidos no meio. Para melhor desgaseificação, recomenda-se utilizar os processos de ultrassom acoplado a bomba de vácuo.

3° item: Filtração de amostras e padrões:

• A maioria das amostras e padrões que serão analisadas em HPLC necessitam de algum tipo de filtração;

• Estas filtrações servem, na maioria das situações, para proteger o equipamento HPLC de possíveis entupimentos de tubulações ou colunas cromatográficas;

• Filtros de seringa mais comuns utilizados em laboratórios são PVDF e PTFE:

  1. PVDF - Polyvinylidene fluoride - Adequado para filtração de solventes orgânicos e aquosos, menos acetona, DMF e Acetonitrila;

  2. PTFE - Politetrafluoretileno - Ampla compatibilidade com solventes orgânicos.

4° item: Colunas de HPLC:

• A primeira recomendação sobre colunas cromatográficas é ler o certificado e verificar as especificações da coluna cromatográfica. No certificado está informado o tipo de aplicação, compatibilidade, dimensões internas e externas da coluna, como armazenar a coluna, como lavar a coluna, faixa de pH de trabalho, temperatura de trabalho, pressão de trabalho, entre outras recomendações;

• Antes de qualquer análise, recomenda-se equilibrar com a fase móvel de 20 a 50 vezes o volume da coluna;

• Conheça o volume morto ou T0 da sua coluna;

• Não é recomendado injetar mais que 1% do volume da coluna vazia para não perder resolução e não comprometer os sítios de ligação da coluna. Cálculo do volume de injeção: V. máximo de injeção = 𝜋. 𝑟2 . comprimento em mm.0,01

5° item: Resíduos do HPLC:

• O descarte dos resíduos de cromatografia devem ser acondicionado em recipiente de polietileno de alta densidade próprio para líquidos inflamáveis e corrosivos;

• Recomenda-se a leitura das FISPQs dos solventes e reagentes utilizados na análise, para evitar incompatibilidades dos resíduos gerados pelo equipamento HPLC.

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